Springen naar inhoud

Relatie tussen dissociatie van eiwit-substraatcomplex en temperatuur


  • Log in om te kunnen reageren

#1

PhilipVoets

    PhilipVoets


  • >25 berichten
  • 69 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 25 mei 2018 - 11:54

Dag iedereen,

 

Ik ben arts bij de Interne Geneeskunde en voor onderzoek naar klaring van eiwitgebonden toxines d.m.v. hemodialyse geïnteresseerd in de relatie tussen dissociatie van het eiwit-toxinecomplex en de reactietemperatuur, aangezien enkel de vrije toxinefractie de dialysemembranen kan passeren. Nu heb ik zelf een poging gedaan dit te modelleren a.d.h.v. associatie-dissociatie-evenwicht ("Hill-achtige" kinetiek) en het beschrijven van de dissociatieconstante volgens de wet van Van 't Hoff. Ik zou graag jullie mening willen over dit model en of ik nog e.e.a. over het hoofd zie. Ik heb het in de bijlage kort samengevat.

 

Vriendelijke groet en bij voorbaat dank!

Bijgevoegde Bestanden


Dit forum kan gratis blijven vanwege banners als deze. Door te registeren zal de onderstaande banner overigens verdwijnen.

#2

PhilipVoets

    PhilipVoets


  • >25 berichten
  • 69 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 25 mei 2018 - 12:08

Een van punten waar ik zelf nog mee worstel, is dat bij logit(theta2) - logit(theta1) het wegstrepen van [UT] enkel mag als die niet verandert, maar zonder verandering van [UT] blijft theta volgens mij ook gewoon constant, dus kan [UT] nooit constant blijven...


#3

Marko

    Marko


  • >5k berichten
  • 9363 berichten
  • VIP

Geplaatst op 26 mei 2018 - 16:33

Op zich klopt deze afleiding. Het is niet zo dat θ niet kan veranderen als [UT] constant blijft. θ is immers gedefinieerd aan de hand van de concentraties vrij en gebonden eiwit.
 
Belangrijk is wel dat de formules hier 2 situaties beschrijven bij verschillende temperaturen maar een gelijke concentratie vrij toxine. Die aanname is niet helemaal terecht, denk ik. Ik zou normaal gesproken verwachten dat bij experimenten bij verschillende temperaturen de totale concentratie toxine ([UT] + [PBUT], ik noem deze concentratie even [UT]0) constant is/gehouden wordt. De aanname kan op zich wel gerechtvaardigd zijn, maar alleen als het grootste deel van het toxine aanwezig is als vrij toxine. In die situaties kun je stellen dat [UT] ≈ [UT]0​ en dan vallen deze termen tegen elkaar weg.

 

Ik weet niet helemaal hoe deze experimenten worden uitgevoerd. Als de totaalconcentratie toxine groter is dan de concentratie bindingsplaatsen op het eiwit, dan kun je bij benadering stellen dat de concentratie vrij toxine niet/nauwelijks veranderd bij veranderende temperatuur. Is dat niet het geval, en wil je een precieze beschrijving van de T-afhankelijkheid van de dissociatie, dan moet de afleiding op een andere manier. Die kan ik hier uitwerken, maar voor een ik hele brij aan LaTeX formules ga typen, wil ik graag zeker weten dat dat waardevol is.

 

Los van de afleiding is het kwalitatief allemaal sowieso inzichtelijk te maken.

 

Er geldt:

 

LaTeX

 

 

en ook:

 

LaTeX

 

Dus als KD stijgt en [UT] constant blijft, dan is de conclusie dat (1-θ)/θ ook stijgt en dat θ dus daalt. Als KD stijgt en [UT] tegelijkertijd daalt, dan geldt hetzelfde. Het enige waar we op basis van deze formules niet direct iets over kunnen zeggen, is wanneer KD stijgt en [UT] tegelijkertijd ook. Maar ook daarvoor geldt in de moleculaire praktijk hetzelfde.

 

Ik ga daarbij uit van hoe ik het experiment voor ogen heb: een oplossing van het eiwit en het toxine, beide in bepaalde concentraties. Die totale concentraties blijven gelijk, alleen variëren we de temperatuur. In zo'n situatie kan [UT] alleen stijgen als [PBUT] daalt (en [P] stijgt), met andere woorden, door een afname van θ.

 

Met andere woorden: Een toename van KD betekent altijd een afname van θ. Het enige wat je moet afleiden is of KD toe of afneemt met toenemende temperatuur. Dat kan inderdaad via de Van 't Hoff vergelijking:

 

LaTeX

 

waaruit direct volgt dat wanneer ΔH positief is, KD bij hogere temperatuur ook hoger zal zijn, en dus (meer) dissociatie optreedt.

 

De vraag is dan dus: is ΔH positief of negatief, met andere woorden, is dissociatie van het eiwit-toxine complex endotherm of exotherm. In de chemische praktijk is het vormen van een binding doorgaans exotherm en het verbreken ervan endotherm. Voor het complex waar het hier om gaat is dat kennelijk ook zo. Het is echter niet zo evident: complexvorming  bij biomoleculen is vaak het gevolg van hydrofobe interacties, en daarvoor kan prima gelden dat ΔH bij dissociatie 0 is of zelfs negatief. Een toename van de temperatuur zal dan leiden tot afname van KD

 

Uit de tekst haal ik dat de binding in dit geval gedreven wordt door elektrostatische interacties. Dan is te verwachten dat ΔH bij dissociatie positief is, dus dat KD toeneemt bij hogere temperatuur.

 

Cetero censeo Senseo non esse bibendum


#4

PhilipVoets

    PhilipVoets


  • >25 berichten
  • 69 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 03 juni 2018 - 10:22

Hartelijk dank voor de uitgebreide reactie. Je schrijft: 

 

5cad214b0dce31052873da41357d2032.png

 

waaruit direct volgt dat wanneer ΔH positief is, KD bij hogere temperatuur ook hoger zal zijn, en dus (meer) dissociatie optreedt.

 

Maar er is toch sprake van een omgekeerd evenredig verband; dat zou willen zeggen dat bij hogere temperatuur K afneemt? Daarnaast vraag ik me af hoe het teken (postief of negatief) voor de standaardenthalpie van de dissociatiereactie van deze toxines bepaald kan worden.

 

Ik hoor graag van je terug!


#5

Marko

    Marko


  • >5k berichten
  • 9363 berichten
  • VIP

Geplaatst op 03 juni 2018 - 21:38

 

Maar er is toch sprake van een omgekeerd evenredig verband; dat zou willen zeggen dat bij hogere temperatuur K afneemt? Daarnaast vraag ik me af hoe het teken (postief of negatief) voor de standaardenthalpie van de dissociatiereactie van deze toxines bepaald kan worden.

 

Ik hoor graag van je terug!

 

K neemt niet standaard af bij hogere temperatuur. Het is, in de chemische praktijk, wel vaak zo, omdat de meeste reacties die we uitvoeren exotherm zijn. Maar het is niet standaard. Het enige dat standaard geldt is

 

LaTeX

 

of:

 

LaTeX

 

Voor ΔG kunnen we schrijven ΔG = ΔH - TΔS waardoor bovenstaande vergelijking ook geschreven kan worden als

 

LaTeX

 
of ook:
 
LaTeX

 

Het eerste stuk is natuurlijk onafhankelijk van de temperatuur. Voor het tweede stuk geldt inderdaad een omgekeerd evenredig verband, maar het is altijd een kwestie van goed kijken wat dit omgekeerd evenredige verband precies voor uitwerking heeft, omdat het ook om een exponentieel verband gaat en er ook nog ergens een min-teken in terugkomt. Zelf moet ik mijn berekeningen ook regelmatig dubbelchecken om zeker te weten dat alles goed staat.

 

Bij hogere temperatuur zal de breuk ΔH/RT dichter bij 0 komen te liggen. Als ΔH < 0, dan wordt de waarde van ΔH/RT minder negatief, dus groter. Is ΔH > 0 dan wordt de waarde kleiner. Echter staat in de vergelijking een min-teken voor ΔH.

 

Dus als ΔH < 0 (exotherme reactie): T stijgt, dan wordt ΔH minder negatief, dus groter, maar -ΔH wordt juist kleiner. En LaTeX

dus ook, dus K ook.

Maar als ΔH > 0 (endotherme reactie): T stijgt, dan wordt ΔH kleiner, maar -ΔH wordt juist groter. En LaTeX

dus ook. 

 

Nu zijn de evenwichten wanneer het gaat om binding aan een eiwit doorgaans geschreven als dissociatie-evenwichten. Links van de pijl staat de gebonden toestand en rechts de toestand met vrije bindingsplaatsen en vrij toxine. De ΔH die we definiëren geldt voor het warmte-effect wanneer we van de gebonden naar de ongebonden toestand gaan, dus wanneer bindingen tussen eiwit en toxine worden verbroken. Dit kost (in het onderhavige geval) warmte, de dissociatie-reactie is endotherm, en (bovenstaande redenering volgend), het dissociatie-evenwicht verschuift naar rechts.

 

Maar dit geldt dus alleen wanneer het warmte kost om de bindingen tussen eiwit en toxine te breken, of omgekeerd: wanneer het warmte oplevert om een binding te maken tussen het eiwit en het toxine. Dit is niet altijd het geval: als de binding (voornamelijk) het gevolg is van hydrofobe interacties (dus: een apolair toxine dat bindt aan apolaire gedeeltes van het eiwit) dan heeft dit met name een entropische component: de binding wordt gemaakt omdat de totale entropie hierdoor toeneemt (kort door de bocht: omdat een aantal watermoleculen hierdoor meer bewegingsvrijheid krijgen). In die gevallen komt bij het maken van de binding nauwelijks tot geen warmte vrij, en het kost dus ook geen warmte om de binding te verbreken. Het verhogen of verlagen van de temperatuur heeft geen effect op de ligging van het evenwicht. 

 

Als de binding echter het gevolg van bijvoorbeeld het maken van waterstofbruggen, elektrostatische interacties en dergelijke, dan komt er wél warmte vrij. Het aangaan van de binding is exotherm, en het verbreken ervan endotherm. Het dissociatie-evenwicht komt dus verder naar rechts te liggen bij hogere temperatuur.

 

 

 

De standaard-enthalpie kan op 2 manieren worden bepaald: Het kan direct, middels calorimetrie (zoals isotherme titratie calorimetrie, ITC) wordt in feite steeds gemeten hoeveel warmte er vrijkomt als er een klein beetje van een oplossing met toxine toegevoegd wordt aan een oplossing met eiwit. Ik weet niet of dat in dit verband praktisch is, maar in theorie kan het.

 

Het kan ook indirect, door bindingsstudies bij verschillende temperaturen uit te voeren en bij iedere temperatuur KD te bepalen. Door ln KD uit te zetten tegen 1/T krijg je een zogenaamde Van 't Hoff-plot waaruit je ΔH en ΔS kan bepalen. Maar in feite is dat in dit geval een omgekeerde redenering: Je constateert dat K op een bepaalde manier afhangt van T, en concludeert daaruit wat ΔH is. In feite is dat wat ik, kwalitatief, in bovenstaand bericht deed: Als KD groter wordt bij hogere temperatuur (en er dus meer dissociatie optreedt), dan zal de dissociatie-reactie endotherm zijn. En dat is, uitgaande van elektrostatische interacties als drijvende kracht, niet onverwacht.

 

Los van het meten van deze thermodynamische parameters zijn ze ook te berekenen met geschikte simulaties: molecular modeling en concreet: docking software. Ik heb daar zelf echter geen verstand van en weet niet of die hier uitkomst kunnen bieden. Ik zou echter verwachten dat dit (zowel het meten als het modelleren) voor iedere chemische biologie of moleculaire biologie-groep in Nederland gesneden koek moet zijn.

Cetero censeo Senseo non esse bibendum


#6

PhilipVoets

    PhilipVoets


  • >25 berichten
  • 69 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 07 juni 2018 - 10:31

Dag Marko,

Wederom hartelijk dank voor de uitgebreide uiteenzetting; dit was wat ik zelf ook ongeveer begreep uit de tekstboeken. Het passeert allemaal netjes de revue tijdens Biochemie in jaar 1 Geneeskunde, maar toch altijd fijn om het nog even terug te horen. Ik heb de aangepaste afleiding in de bijlage toegevoegd. Misschien wil je er eens een blik op werpen (zie ook PM/bericht). Als kleine bijkomstigheid is er overigens (in een studie van Devine et al., Toxins, 2016) een lineair verband tussen de NaCl-concentratie en KD beschreven; deze evenredigheid heb ik ook opgenomen. Door dialyseklaring te beschrijven als een diffusieproces volgens de wet van Fick kun je zo een relatie afleiden tussen de dialyseklaring van eiwitgebonden toxines en de chemische/fysische parameters die hierop invloed hebben. Hoor graag van je!

 

Nogmaals dankend,

Philip

Bijgevoegde Bestanden

  • Bijlage  PBUT.docx   26,67K   10 maal gedownload

Veranderd door PhilipVoets, 07 juni 2018 - 10:36


#7

Marko

    Marko


  • >5k berichten
  • 9363 berichten
  • VIP

Geplaatst op 17 juni 2018 - 13:52

Beste Philip,

 

Een paar opmerkingen bij je model:

 

- Je noemt dat binding met toxines gedreven is door elektrostatische interacties. Dit is (denk ik) niet in zijn algemeenheid waar. Er zullen gevallen zijn waarin toxines op hydrofobe bindingsplaatsen van een eiwit gaan zitten (al dan niet gepaard met conformatieveranderingen van het eiwit), en dan is de binding niet gedreven door elektrostatische interacties.

 

- Je schrijft dat [UT] proportioneel is met KD. Dit geldt alleen als [P]/[PBUT] constant is, maar dat is niet het geval als KD verandert. Bij verder gelijkblijvende omstandigheden, zal gelden dat dissociatie zal toenemen. [UT] neemt toe, [P] neemt toe, en [PBUT] neemt af, dus [P]/[PBUT] verandert. In welke mate dit gebeurt hangt af van de mate waarin bindingsplaatsen verzadigd zijn. Je zult aan de hand van concrete getallen (voor KD, en typische concentraties voor toxine en eiwit) moeten berekenen wat er precies gebeurt, dit kan (onder omstandigheden) zelfs vrijwel niets zijn. Ik zal eens op zoek gaan naar getallen in dat artikel (of als je ze zo kunt geven, uiteraard fijn), en kan aan de hand daarvan een inschatting maken.

 

- Ik kan mij voorstellen dat er een verband is tussen NaCl-concentratie en KD en kan mij ook voorstellen dat dit in een bepaald bereik (min of meer) lineair is. Immers, bij eerste benadering is alles lineair. In zijn algemeenheid zou ik echter verwachten dat er een lineair verband is tussen de NaCl-concentratie en de vrije energie ΔG behorende bij deze dissociatiereactie, en dus overall een exponentieel verband.

 

- De koppeling aan diffusie maakt het wat ingewikkelder. Ik kan mij zo voorstellen dat de binding aan het eiwit sterk is en dissociatie langzaam verloopt; langzaam ten opzichte van diffusie naar de dialysestroom. In dat geval maakt het weinig uit of de concentratie [UT] in die stroom 0 is, of vrijwel 0, en het maakt ook niet uit of de diffusiecoëfficiënt afhangt van T. Aan de andere kant van het spectrum zit de casus waarin dissociatie en binding aan het eiwit snel verlopen, en dan bepaalt enkel de snelheid van het diffusieproces hoe snel de klaring verloopt. Wat daarbij scheelt is dat de diffusiecoëfficiënt op dezelfde manier afhangt van T als de KD dat doet, dus de proportionaliteit verandert niet. Het effect van [NaCl] zal wel anders zijn: bij hogere zoutconcentraties zal de viscositeit van het medium toenemen en de diffusiecoëfficiënt af. Dit alles overigens onder de aanname dat diffusie door het membraan heen niet de beperkende factor is.

 

Bottom line: de benadering is op zich juist, maar het zal van de precieze situatie afhangen of de afhankelijkheden zoals ze afgeleid zijn ook inderdaad zo optreden. 

Cetero censeo Senseo non esse bibendum


#8

PhilipVoets

    PhilipVoets


  • >25 berichten
  • 69 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 24 juni 2018 - 11:07

Dag Marko,

 

Allereerst, hartelijk dank weer voor de uitgebreide analyse. Ik heb hieronder een aantal opmerkingen geplaatst.

 

 

Beste Philip,

 

Een paar opmerkingen bij je model:

 

- Je noemt dat binding met toxines gedreven is door elektrostatische interacties. Dit is (denk ik) niet in zijn algemeenheid waar. Er zullen gevallen zijn waarin toxines op hydrofobe bindingsplaatsen van een eiwit gaan zitten (al dan niet gepaard met conformatieveranderingen van het eiwit), en dan is de binding niet gedreven door elektrostatische interacties.

 

De binding betreft vooral stoffen als indoxylsulfaat en p-cresylsulfaat (als het prototype uremische toxine) met albumine in serum. Volgens de literatuur die ik heb kunnen terugvinden berust de vorming van het PBUT vooral op elektrostatische en Van der Waals-bindingen (zie o.a.: https://www.ncbi.nlm...es/PMC3942743/)

 

- Je schrijft dat [UT] proportioneel is met KD. Dit geldt alleen als [P]/[PBUT] constant is, maar dat is niet het geval als KD verandert. Bij verder gelijkblijvende omstandigheden, zal gelden dat dissociatie zal toenemen. [UT] neemt toe, [P] neemt toe, en [PBUT] neemt af, dus [P]/[PBUT] verandert. In welke mate dit gebeurt hangt af van de mate waarin bindingsplaatsen verzadigd zijn. Je zult aan de hand van concrete getallen (voor KD, en typische concentraties voor toxine en eiwit) moeten berekenen wat er precies gebeurt, dit kan (onder omstandigheden) zelfs vrijwel niets zijn. Ik zal eens op zoek gaan naar getallen in dat artikel (of als je ze zo kunt geven, uiteraard fijn), en kan aan de hand daarvan een inschatting maken.

 

Eens, dat was ook al mijn zorg inderdaad. Beetje wet van de communicerende vaten. Dit stuk blijft nog een beetje een knelpunt.

 

- Ik kan mij voorstellen dat er een verband is tussen NaCl-concentratie en KD en kan mij ook voorstellen dat dit in een bepaald bereik (min of meer) lineair is. Immers, bij eerste benadering is alles lineair. In zijn algemeenheid zou ik echter verwachten dat er een lineair verband is tussen de NaCl-concentratie en de vrije energie ΔG behorende bij deze dissociatiereactie, en dus overall een exponentieel verband.

 

De aanname dat er sprake is van een lineaire relatie volgt uit de experimenten van Devine et al. (zie bovenstaande link); ik ben het helemaal met je eens dat het enkel bij benadering en enkel binnen een zekere range zo zal zijn. Gelukkig correspondeert die range wel met wat fysiologisch nog haalbaar is. Zoals wel vaker het geval is, ben je gehouden aan de grenzen van wat de fysiologie toelaat (e.g., denaturatie van enzymen en transporters boven bepaalde temperatuur, osmotische lysis van cellen bij te hoge NaCl-concentratie, etc.)

 

- De koppeling aan diffusie maakt het wat ingewikkelder. Ik kan mij zo voorstellen dat de binding aan het eiwit sterk is en dissociatie langzaam verloopt; langzaam ten opzichte van diffusie naar de dialysestroom. In dat geval maakt het weinig uit of de concentratie [UT] in die stroom 0 is, of vrijwel 0, en het maakt ook niet uit of de diffusiecoëfficiënt afhangt van T. Aan de andere kant van het spectrum zit de casus waarin dissociatie en binding aan het eiwit snel verlopen, en dan bepaalt enkel de snelheid van het diffusieproces hoe snel de klaring verloopt. Wat daarbij scheelt is dat de diffusiecoëfficiënt op dezelfde manier afhangt van T als de KD dat doet, dus de proportionaliteit verandert niet. Het effect van [NaCl] zal wel anders zijn: bij hogere zoutconcentraties zal de viscositeit van het medium toenemen en de diffusiecoëfficiënt af. Dit alles overigens onder de aanname dat diffusie door het membraan heen niet de beperkende factor is.

 

Ja, daar heb je inderdaad een punt, haha.

 

Bottom line: de benadering is op zich juist, maar het zal van de precieze situatie afhangen of de afhankelijkheden zoals ze afgeleid zijn ook inderdaad zo optreden. 

 

In ieder geval nogmaals dank, hoor graag van je terug!

 

Groeten, Philip


#9

PhilipVoets

    PhilipVoets


  • >25 berichten
  • 69 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 24 juni 2018 - 19:14

T.a.v. je laatste alinea uit je vorige bericht: ik begrijp van je dat als de dissociatie van het complex tot vrij eiwit en vrij toxine relatief traag verloopt (en dus de rate-limiting step is), de temperatuur-afhankelijkheid van de diffusieconstante bij benadering verwaarloosd mag worden. Dat zou betekenen dat de klaring afhankelijk is van temperatuur volgens: Cl ~ T/(T+C) i.p.v. Cl ~ T^2/(T+C) --> het kwadraat in deze tweede vergelijking reflecteert de lineaire afhankelijkheid van de diffusieconstante van temperatuur (zie afleiding), maar als de diffusie over de membraan toch verwaarloosd mag worden als zijnde niet 'rate-limiting', vervalt het kwadraat en volgt de eerste vergelijking daar weer uit). Het tweede deel van je laatste alinea volg ik niet helemaal; de diffusieconstante hangt exponentieel af van temperatuur terwijl er een lineair verband bestaat tussen diffusieconstante en temperatuur. Is het dan niet te kort door de bocht om te stellen dat ze beide op dezelfde manier van temperatuur afhangen?

 

Gr.

 

Philip

Veranderd door PhilipVoets, 24 juni 2018 - 19:18






0 gebruiker(s) lezen dit onderwerp

0 leden, 0 bezoekers, 0 anonieme gebruikers

Ook adverteren op onze website? Lees hier meer!

Gesponsorde vacatures

Vacatures