[scheikunde] Immunologie kinetische turbiditeitsmeting

Val232rio Cosemans

Dag iedereen

Ik begrijp iets niet van de kinetische turbiditeitmeting voor een immunologische reactie.

Wat ik wel begrijp:

° De Heidelberger-Kendall curve zegt dat een ondermaat en overmaat antigen bij een constante concentratie antilichaam leidt tot minder troebeling.
° Dat betekent wel dat twee verschillende concentraties antigeen dezelfde absorbantie kunnen geven --> hierom doen ze een kinetische meting

De vragen die ik me stel en die niet in de cursus staan:

° Ze meten absorbantie in functie van de tijd. Deze curve is sigmoïdaal. Het buigpunt is Vmax en dit op tijdstip tmax. Dus:

°°° Vmax neemt toe als de concentratie antigen toeneemt?
°°° Op tijdstip tmax dan is de reactie nog niet gedaan toch?

°°° Hoe gaan ze dan uit de Vmax ifv tijd grafiek de concentratie antigen bepalen? ( Een ijklijn maken? (absorbantie ifv concentratie antigen, maar als je twee concentraties hebt met dezelfde absorbantie dan is de ijklijn toch niet recht?)

Ik vind dat er op internet niks deftigs te vinden is hierover of ik geef de verkeerde zoektermen in.

Hoe werkt die kinetische meting hier precies?

Groetjes

Valerio

Beresteyn

Ze meten absorbantie in functie van de tijd. Deze curve is sigmoïdaal. Het buigpunt is Vmax en dit op tijdstip tmax. Dus:

Heb je een plaatje van de curve die jij bedoelt? Want die van Heidelberger-Kendall is een paraboolachtige curve. De curve geeft simpelweg de ratio tussen antigen en antistof aan bij bepaalde concentraties. Je kan echter wel een sigmoïdale curve krijgen als je stopt op het equivalentiepunt. Daarnaast denk ik dat er beter gesproken kan worden over een C_max dan een V_max. Echter ken ik de curve inhoudelijk te slecht om daarover een uitspraak te doen. Ik vermoed dat je in sommige delen van je vraag juist de Michaelis-Menten curve bedoelt?!

Vmax neemt toe als de concentratie antigen toeneemt?

Wat is een V_max? En wat kun je dan, op basis van die kennis, zeggen over de verschuiving van de V_max bij kwantitatieve (antigen concentraties) en kwalitatieve (affiniteit) verschillen van de antigenen?

Gebruik eventueel onderstaande grafiek (slechte resolutie) om tot je antwoord te komen.

: Schermafbeelding 2018-06-12 om 15.00.57.png (120.23 KiB) 1198 keer bekeken

Legenda (zie I en II als een paar en III en IV als een paar):
I = zuiver rund IgG 5,0 mg/mL
II = serum rund 2,5 mg/mL
III = serum varken 2,5 mg/mL
IV = serum varken 0,1 mg/mL
Antistof: anti-rund IgG 0,2 mL
Unlabeled curve = zuiver rund IgG 5,0 mg/mL bij een anti-rund IgG van 0,1 mL

Op tijdstip tmax dan is de reactie nog niet gedaan toch?

Er is niet echt een eindpunt van een reactie, nietwaar?
Bij het equivalentiepunt, de V_max, is de ratio antigen:antistof 1 : 1. Daarvóór is deze ratio 1 : >1 en daarná >1 : 1.
t_max is dus inderdaad de tijd waarin V_max, de maximale precipitatie, bereikt wordt. Vervolgens kunnen de gevormde complexen weer loslaten en ook als er meer antigenen worden toegevoegd aan het mengsel, dan kan de precipitatie weer (sterk) afnemen. Het is een dynamisch geheel, dus afhankelijk van de omstandigheden waarmee je de meting verricht (en afhankelijk van wat je wil weten) kun je een eindpunt van de reactie definiëren.

Hoe gaan ze dan uit de Vmax ifv tijd grafiek de concentratie antigen bepalen?

Hiermee kan ik je niet helpen, daarvoor ken ik de curve inhoudelijk onvoldoende. Maar zoals ik al eerder zei, op het equivalentiepunt is de ratio 1:1. De concentratie antistof weet je als het goed is. Dus ik vermoed dat het gewoon een kwestie van aflezen is, maar weet dat dus niet zeker.

Val232rio Cosemans

Hier zijn enkele afbeeldingen waarop al de uitleg staat die gegeven wordt in de cursus.

Maar voor is het niet geheel duidelijk.

: 35229524_10210078004261661_6844687769575358464_n.jpg (81.44 KiB) 1200 keer bekeken

: 35123784_10210078004341663_5328978872920702976_n.jpg (156.6 KiB) 1201 keer bekeken

: 35162164_10210078004101657_7802120019478839296_n.jpg (41.61 KiB) 1200 keer bekeken

Beresteyn

Aha, dat maakt het een en ander wel wat duidelijker. Laat in ieder geval duidelijk zijn dat een Heidelberger-Kendall curve gebaseerd is op relatie tussen de antigen concentratie en de mate van precipitatie bij een vaste hoeveelheid antistof (zie onderstaande afbeelding). Het weergeeft dus ook de ratio antigen ten opzichte van antistof. De precipitatie wordt gemeten door de hoeveelheid doorgelaten licht door het mengsel. Je kunt je vast wel voorstellen dat die gevormde immuuncomplexen een deel van het licht zullen blokkeren (door vertroebeling). De hoeveelheid doorgelaten licht is daarmee een maat voor de vorming van immuuncomplexen, oftewel de precipitatie.

: Afbeelding1.png (75.35 KiB) 1198 keer bekeken

Source: figure attained and modified from Jacobs et al. (2015). Antigen excess in modern immunoassays: To anticipate on the unexpected. Autoimmunity Reviews, 14(2): 160-167.

In de tweede curve (met de sigmoïdale vorm) is de precipitatie van twee individuele concentraties gemeten in de tijd. Bij deze curve is tijdstip t_max, op het equivalentiepunt, dus de tijd die nodig is om alle mogelijke immuuncomplexen te vormen. V_max haal je uit het equivalentiepunt van de eerste curve. Ik vind het nog steeds raar dat jullie dat de V_max noemen, maar dat kan ook komen omdat ik vanuit de farmacologie een andere definitie ken; en het maakt voor het begrijpen van de curve verder niet uit.

Om terug te komen op je eerste vraag. De V_max zegt alleen iets over de snelheid van de reactie. Zie de afbeelding in m'n vorige reactie: in curve I en II zijn dezelfde IgG's gebruikt, maar bij verschillende concentraties. Curve I bevat een hogere concentratie en bereikt de V_max dan ook eerder dan curve II. Je ziet ditzelfde verschil ook tussen curve III en IV. Deze curves liggen echter ook iets lager vanwege een verminderde precipitatie. Waarom? Omdat hierbij gebruik gemaakt is van antigenen van een ander dier. De affiniteit is dus lager en er vormen minder complexen. Je ziet dus dat de V_max alleen verandert als er sprake is van een kwalitatief verschil. Bij kwantitatieve verschillen, dus bij verschillende concentraties, zie je een laterale verschuiving van de curve.

Wetenschapsforum

Laatste berichten

Nieuwsberichten

[scheikunde] Immunologie kinetische turbiditeitsmeting

Immunologie kinetische turbiditeitsmeting

Re: Immunologie kinetische turbiditeitsmeting

Re: Immunologie kinetische turbiditeitsmeting

Re: Immunologie kinetische turbiditeitsmeting