Dag iedereen
Ik heb een vraag over DNA exractie.
Je voegt eerst een cellysis buffer toe. Hierin zitten chaotrope zouten die ervoor zorgen dat proteïnen neerslaan en het celmembraan oplost.
Waarom slaat het DNA niet neer?
Zouden de negatieve ladingen van de backbone van het DNA niet net afgeschermd worden waardoor het minder hydrofiel wordt en neerslaat?
Groetjes
Valerio
Laatste berichten
-
23:12
speciale rel. theorie 10
-
22:57
Straatklok loopt 5 minuten voor 11
-
22:57
wig 6
-
22:36
Gravity and gravitation 4
-
22:24
[scheikunde] vraag Chemie - wat is de oplossing? 10
-
19:47
Bruine vlekken op treinaanwijzerbord 10
-
19:44
Vogels in de stad zijn goede klussers 2
-
19:12
Rood laserlicht 3
-
17:30
Herleiden afmetingen vanaf een foto 21
-
16:34
[wiskunde] Prijs Product per KG; Alternatief Inzicht 3
-
13:57
do-re-mi-fa-so vliegtuigen 9
-
13:16
geen minkowski-ruimte toch? Doe ik dit nou fout? 17
-
13:12
[natuurkunde] kroon van koning op Syracuse 10
-
10:15
2013 – Augustus Vraag 3 3
-
24 apr
Vraag 2009 Juli Vraag 5 5
-
24 apr
positie 2
-
24 apr
Schroefdraad berekening 8
-
24 apr
[scheikunde] Kan chloorgas de geleiding van elektriciteit belemmeren? 9
-
23 apr
Weerfrustratie 9
-
23 apr
Kunnen quantum Zonnecellen 190% quantum efficiënt zijn 3
Nieuwsberichten
-
04 mar
Een nieuw soort magnetisme: altermagnetisme
-
31 okt
AI kan via stem diabetes vaststellen 11
-
21 okt
Einstein krijgt wéér gelijk 45
-
07 feb
witter dan wit 20
-
19 jun
irrigatie en de aardas
[biologie] DNA extractie
Moderators: ArcherBarry, Fuzzwood
-
- Berichten: 383
Re: DNA extractie
Val232rio Cosemans schreef: Je voegt eerst een cellysis buffer toe. Hierin zitten chaotrope zouten die ervoor zorgen dat proteïnen neerslaan en het celmembraan oplost.
Waarom slaat het DNA niet neer?
Zouden de negatieve ladingen van de backbone van het DNA niet net afgeschermd worden waardoor het minder hydrofiel wordt en neerslaat?
Ik weet niet over welke extractie-methode je het precies hebt maar het is in elk geval zo dat proteïnen tegelijk polaire- en apolaire eigenschappen hebben. Als ze denatureren en dus ontrollen (in een polaire omgeving), dan zullen de apolaire groepen aan de buitenkant komen te liggen en zullen dezen in een polair midden elkaar opzoeken, samenklitten en neerslaan. Het DNA, daarentegen, is zeer polair en daarom dat je met zout (vanwege Na+) de negatieve ladingen neutraliseert (wat je zelf zei), anders zou het uit elkaar vallen (we willen het nog steeds zien, niet?) want we zitten nog steeds in een polair midden. Nu kan je de eiwitten uitcentrifugeren. Enkele eiwitten zullen polair genoeg zijn om bij het DNA te blijven maar dat onderzoek je met UVvis: 260nm - 280nm. Als je nu wil dat ook het DNA neerslaat, giet er dan maar eens een hele flinke scheut ethanol (apolair) bij!
-
- Berichten: 421
Re: DNA extractie
Hier ben ik niet volledig mee. Wat bedoel je met uiteenvallen?Daaf schreef:
Het DNA, daarentegen, is zeer polair en daarom dat je met zout (vanwege Na+) de negatieve ladingen neutraliseert (wat je zelf zei), anders zou het uit elkaar vallen (we willen het nog steeds zien, niet?) want we zitten nog steeds in een polair midden.
Maar als de negatieve ladingen van de backbone worden geneutraliseerd door Na+ ionen van het zout dan wordt het DNA toch ook slechter oplosbaar of zie ik dat verkeerd?
Bij de fenol/chloroform methode zitten er chaotrope zouten in de lysisbuffer. Waarom doen die chaotrope zouten het DNA niet neerslaan samen met de eiwitten? En slaat het DNA wel neer als je later in deze methode een zout (NaAc) en ethanol toevoegt.
-
- Berichten: 383
Re: DNA extractie
Dat zie je niet verkeerd maar het heeft te maken met het bovenstaande, vergeet het nog eventjes a.u.b..
Bij de fenol/chloroform methode zitten er chaotrope zouten in de lysisbuffer. Waarom doen die chaotrope zouten het DNA niet neerslaan samen met de eiwitten? En slaat het DNA wel neer als je later in deze methode een zout (NaAc) en ethanol toevoegt.
En hier zijn we er! De chaotrope zouten zijn niet de oorzaak van het wel of niet neerslaan (toch niet direct), ze zorgen voor: de afbraak van membranen en zo komt het DNA vrij, mitochondria, ER en de 3D structuur van eiwit gaan er ook aan. Je "kit" is zo samengesteld dat het DNA intact blijft (ik denk dat DNA een goede bescherming heeft door die heel negatieve lading op de fosfaatgroepen maar ik weet niet zeker of dit wel de reden is, het gaat om de juiste verhouding van chaotroop zout, denk ik zo). We doen er nu fenol (en chloroform) bij en dat mixt niet met water, is bovendien dichter en veel apolairer dan water en zakt naar de bodem en neemt alle apolaire deeltjes mee (eiwit-overblijfselen (zie in mijn eerste post waarom proteïnen eerder apolair zijn), celfragmenten) - Het polaire DNA gaat naar boven, in de waterige oplossing en nu kunnen we het eruit halen.
Nu doen we er ethanol bij en ethanol heeft een zeer apolair karakter - enkel zijn OH-groep houdt hem in het water, ja, hoe moet DNA nu nog oplossen? Niet, het slaat neer!
En natriumacetaat dient voor de pH maar ik weet niet juist hoe dit werkt maar ik denk toch ook dat het een werking heeft v.w.b. het "neutraliseren" van de backbone v.w.b. de negatieve ladingen uitschakelen zodat de DNA-moleculen elkaar niet afstoten.
Beste Valerio, ik ben ook maar een student en doe enkel mijn best!
Groeten, David
Bij de fenol/chloroform methode zitten er chaotrope zouten in de lysisbuffer. Waarom doen die chaotrope zouten het DNA niet neerslaan samen met de eiwitten? En slaat het DNA wel neer als je later in deze methode een zout (NaAc) en ethanol toevoegt.
En hier zijn we er! De chaotrope zouten zijn niet de oorzaak van het wel of niet neerslaan (toch niet direct), ze zorgen voor: de afbraak van membranen en zo komt het DNA vrij, mitochondria, ER en de 3D structuur van eiwit gaan er ook aan. Je "kit" is zo samengesteld dat het DNA intact blijft (ik denk dat DNA een goede bescherming heeft door die heel negatieve lading op de fosfaatgroepen maar ik weet niet zeker of dit wel de reden is, het gaat om de juiste verhouding van chaotroop zout, denk ik zo). We doen er nu fenol (en chloroform) bij en dat mixt niet met water, is bovendien dichter en veel apolairer dan water en zakt naar de bodem en neemt alle apolaire deeltjes mee (eiwit-overblijfselen (zie in mijn eerste post waarom proteïnen eerder apolair zijn), celfragmenten) - Het polaire DNA gaat naar boven, in de waterige oplossing en nu kunnen we het eruit halen.
Nu doen we er ethanol bij en ethanol heeft een zeer apolair karakter - enkel zijn OH-groep houdt hem in het water, ja, hoe moet DNA nu nog oplossen? Niet, het slaat neer!
En natriumacetaat dient voor de pH maar ik weet niet juist hoe dit werkt maar ik denk toch ook dat het een werking heeft v.w.b. het "neutraliseren" van de backbone v.w.b. de negatieve ladingen uitschakelen zodat de DNA-moleculen elkaar niet afstoten.
Beste Valerio, ik ben ook maar een student en doe enkel mijn best!
Groeten, David
Opmerking moderator
bij het reageren graag de "reply" functie gebruiken en niet standaard de "citaat" functie. nutteloos citeren wordt als storend ervaren.
citaat functie verwijderd.
citaat functie verwijderd.
-
- Berichten: 421
Re: DNA extractie
Ik heb het bovenstaande nog eens nagekeken en bestudeerd en heb ook nog wat gezocht in boeken/internet. Het volgende heb ik er uit kunnen halen maar, ik stel me toch nog wel wat vragen. Hieronder een voorstel
START: Een oplossing van eiwitten en DNA ( in water, beide zijn opgelost.)
° Toevoegen chaotroop zout: LiClO4 LiClO4 --> Li+ + ClO4-
Wat gebeurt met eiwitten:
Een lagere concentratie zout doet eiwitten net beter oplossen --> stabilisatie, gaat samenklonteren van eiwitten tegen.
Een te hoge concentratie zout doet eiwitten slechter oplossen --> destabilisatie, het samenklonteren wordt weer in de hand gewerkt. Er is een soort competitie tussen eiwitten en zout ionen om water rondom zich te hebben.
Wat gebeurt met DNA: ( Ik volg de redenering zoals bij eiwitten)
De Li+ ionen zorgen voor een stabilisatie van de negatieve ladingen op de fosfaatgroepen. (Bij lage concentraties aan zout wordt het DNA meer oplosbaar?)
Bij hoge concentraties aan zout wordt het DNA minder oplosbaar? Als je heel veel zout toevoegt dan zou je een competitie krijgen tussen DNA en zout ionen om water rondom zich te hebben. Dus dan zitten er minder watermoleculen rondom het DNA waardoor slechter oplosbaar.
Van samenklonteren is wel geen sprake bij DNA want DNA moleculen zijn negatief geladen en stoten elkaar dus af.
Het hangt dus allemaal af van de concentratie van het zout. Wellicht heb je een hogere concentratie zout nodig dan bij eiwitten om DNA neerslaan in water. ( Zou dat dan net zijn doordat DNA niet kan samenklonteren?)
Ik had op het internet nog iets gevonden over 'permitiviteitsconstante' en dat die voor water veel hoger is dan voor ethanol. Hoe hoger die constante te zwakker de coulombkrachten, (dus hogere oplosbaarheid?)
(Ik denk graag na over de dingen omdat ik een leergierig persoon ben)
Groetjes
Valerio
START: Een oplossing van eiwitten en DNA ( in water, beide zijn opgelost.)
° Toevoegen chaotroop zout: LiClO4 LiClO4 --> Li+ + ClO4-
Wat gebeurt met eiwitten:
Een lagere concentratie zout doet eiwitten net beter oplossen --> stabilisatie, gaat samenklonteren van eiwitten tegen.
Een te hoge concentratie zout doet eiwitten slechter oplossen --> destabilisatie, het samenklonteren wordt weer in de hand gewerkt. Er is een soort competitie tussen eiwitten en zout ionen om water rondom zich te hebben.
Wat gebeurt met DNA: ( Ik volg de redenering zoals bij eiwitten)
De Li+ ionen zorgen voor een stabilisatie van de negatieve ladingen op de fosfaatgroepen. (Bij lage concentraties aan zout wordt het DNA meer oplosbaar?)
Bij hoge concentraties aan zout wordt het DNA minder oplosbaar? Als je heel veel zout toevoegt dan zou je een competitie krijgen tussen DNA en zout ionen om water rondom zich te hebben. Dus dan zitten er minder watermoleculen rondom het DNA waardoor slechter oplosbaar.
Van samenklonteren is wel geen sprake bij DNA want DNA moleculen zijn negatief geladen en stoten elkaar dus af.
Het hangt dus allemaal af van de concentratie van het zout. Wellicht heb je een hogere concentratie zout nodig dan bij eiwitten om DNA neerslaan in water. ( Zou dat dan net zijn doordat DNA niet kan samenklonteren?)
Ik had op het internet nog iets gevonden over 'permitiviteitsconstante' en dat die voor water veel hoger is dan voor ethanol. Hoe hoger die constante te zwakker de coulombkrachten, (dus hogere oplosbaarheid?)
(Ik denk graag na over de dingen omdat ik een leergierig persoon ben)
Groetjes
Valerio
-
- Berichten: 383
Re: DNA extractie
Beste Valerio,
Ik volg uw redenering en ik denk ook dat het om de precieze concentratie van het zout gaat (en dus de samenstelling van de kit).
Het lijkt me echter dat u DNA als een eiwit ziet maar dat is niet zo (poly-nucleotide versus poly-peptide). DNA MAAKT eiwitten maar is zelf geen eiwit - de natuur van beiden is dus niet hetzelfde!
Persoonlijk denk ik dat het iso-elektrisch punt van DNA net op de juiste plaats ligt t.o.v. het pI van de (meeste) eiwitten om te kunnen oplossen in "die bepaalde concentratie met zout" maar ik weet dit niet zeker, het lijkt me wel logisch.
Bekijk deze bedenkingen eens even en zeg wat u ervan vindt.
Zelf ben ik ook zeer leergierig en alhoewel het niet meteen in mijn gebied (biologie) ligt (wij gebruiken gewoon de kit), vind ik uw vraag zeer interessant!
Als we er zelf niet uitkomen stuur ik een mailtje naar de prof van moleculaire, vakantie of niet!
Groeten, David
Ik volg uw redenering en ik denk ook dat het om de precieze concentratie van het zout gaat (en dus de samenstelling van de kit).
Het lijkt me echter dat u DNA als een eiwit ziet maar dat is niet zo (poly-nucleotide versus poly-peptide). DNA MAAKT eiwitten maar is zelf geen eiwit - de natuur van beiden is dus niet hetzelfde!
Persoonlijk denk ik dat het iso-elektrisch punt van DNA net op de juiste plaats ligt t.o.v. het pI van de (meeste) eiwitten om te kunnen oplossen in "die bepaalde concentratie met zout" maar ik weet dit niet zeker, het lijkt me wel logisch.
Bekijk deze bedenkingen eens even en zeg wat u ervan vindt.
Zelf ben ik ook zeer leergierig en alhoewel het niet meteen in mijn gebied (biologie) ligt (wij gebruiken gewoon de kit), vind ik uw vraag zeer interessant!
Als we er zelf niet uitkomen stuur ik een mailtje naar de prof van moleculaire, vakantie of niet!
Groeten, David
-
- Berichten: 421
Re: DNA extractie
Hiervan ben ik me wel bewustDaaf schreef: Het lijkt me echter dat u DNA als een eiwit ziet maar dat is niet zo (poly-nucleotide versus poly-peptide). DNA MAAKT eiwitten maar is zelf geen eiwit - de natuur van beiden is dus niet hetzelfde!
Hier had ik nog niet aan gedacht zelfs.Daaf schreef: Persoonlijk denk ik dat het iso-elektrisch punt van DNA net op de juiste plaats ligt t.o.v. het pI van de (meeste) eiwitten om te kunnen oplossen in "die bepaalde concentratie met zout" maar ik weet dit niet zeker, het lijkt me wel logisch.
Ik zal zelf ook eens een mailtje doen naar mijn docent.
Groetjes
Valerio
-
- Berichten: 383
Re: DNA extractie
Laat je de uiteindelijke oplossing weten als je er achter bent gekomen?
Dank en groeten, David
Dank en groeten, David
