Destructie van lipiden onder zoutzuur

[Kaasbaaz]

Hallo allemaal,

Op mijn stage doen we een vet bepaling op basis van een extractie met petroleumether. Hiervoor behandelen we het monster in een kokende zoutzuur oplossing om al het vet "vrij" te maken. Helaas is voor deze destructie stap niet compleet bekend welke reacties precies plaatsvinden en kan niemand hier mij een duidelijk antwoord geven.

Zo ver wat ik wel zeker weet is dat het vet niet word gehydrolyseerd en de concentratie zoutzuur is ongeveer 4 molair (pH= -0.5).


Zou iemand voor mij kunnen verhelderen welke reacties plaats vinden en op welke stoffen? Het zijn voornamelijk voedingsmonsters en het doel is natuurlijk vet vrij maken om geëxtraheerd te worden.

[Benm]

Waarom werk je hier met zuur?

Als je vetzuren wilt vrij maken uit triglyceriden dan lijkt het me logischer om dat met een base te doen (verzeping).

[Kaasbaaz]

Waarom werk je hier met zuur?

Als je vetzuren wilt vrij maken uit triglyceriden dan lijkt het me logischer om dat met een base te doen (verzeping).

Sorry voor de onduidelijkheid. Wat we hier proberen te doen is triglyceriden vrijmaken voor een makkelijke extractie. Mij is verteld dat de triglyceriden vast kunnen zitten tussen lange eiwit ketens, hier koken we de eiwitten kapot (d.m.v. hydrolyse volgens mij) zodat het vet los komt. Ook koken dierlijke cellen die mogelijk vet bevatten in het cytoplasma hier kapot zodat dit ook vrij komt.

Aan het einde blijft er alleen een zwarte drap over, dus ik kan me niet voorstellen dat dit het enige is wat er gebeurd. Mijn vraag hierbij is welke reacties nog meer optreden.

En als bonusvraag waarom de triglyceriden niet hydrolyseren

[Benm]

Ah, op die manier. Zoutzuur zal de eiwitten inderdaad wel hyrdolyseren, wellicht treed er ook de nodige oxidatie op en dergelijke. Als je eiwit op die manier hydrolyseert kan het wel een zwarte smurrie worden, vergelijkbaar met een soort dikke maggie of ketjap of iets dergelijks. Triglyceriden zijn met zoutzuur alleen nauwelijks te hydrolyseren.

Wat zijn je monsters eigenlijk, en wat wil je er exact van weten?

[Kaasbaaz]

Onze monsters zijn heel variërend want het is een commercieel analytisch lab, maar we zien veel kattenvoer, karamel, gebakmix, frisdrank en vleesproducten.

Mij is verteld dat we alleen triglyceride meten, maar qua monstervoorbereiding doen we alleen deze destructie met zoutzuur en spoelen we het resultaat hiervan met demiwater in een filter tot al het zuur er uit is. Dus wanneer we het vet extraheren met petroleumether nemen we ook alle andere apolaire stoffen mee die niet zijn afgebroken door het zoutzuur of opgelost in het water tijdens het zuurvrij spoelen.

Wat ik tot nu toe weet over de destructie is eigenlijk alleen wat jij mij hebt verteld; De oplossing wordt zwart met neerslag door het gehydrolyseerde eiwit, en de triglyceriden hydrolyseren hier niet.
De vraag is wat er allemaal gebeurt tijdens dit proces, want als het alleen het afbreken van eiwitten is we deze ook uit de mix kunnen halen met een Carrez oplossing. Ik ga er van uit dat dit proces meer gaat over het vrij maken van vet dan het uitfilteren van stoffen die ook geëxtraheerd worden aangezien we bij een andere methode alleen de extractie doen zonder destructie (voornamelijke op vette producten zoals chocola of vlees) zonder extra risico voor storende stoffen.

Wat me ook is opgevallen is dat gehakt monsters geen zwarte oplossing worden met zwarte neerslag na de destructie maar helder licht bruin met witte neerslag. Heb jij hier misschien een verklaring voor? Zou de witte neerslag puur vet kunnen zijn dat niet oplost in het polaire water?

[Benm]

Dat laatste zou kunnen, al zou ik niet weten waarom een monster van gehakt geen zwarte smurrie oplevert maar een monster van datzelfde vlees maar niet-fijngehakt wel.

Als je puur naar de vetten wilt kijken kun je het wellicht ook anders aanpakken met een veel minder chemisch agressieve methode. Je kunt eiwitten kapot maken door hydrolyse met sterk zoutzuur en verhoogde temperatuur, maar je kunt dan ook enzymatisch doen met proteasese bij pakweg lichaamstemperatuur.

Als ik het in elkaar zou moeten zetten zou ik dat dat laatste doen: eerst de hele boel zo fijn mogelijk maken, met een "blender" en eventueel een sonicator (om celmembranen mee te breken), dan behandelen met en protease, en op dat punt de vetten scheiden van de rest. De vetten zijn dan nog trigyliceriden en wellicht ook wat vrije vetzuren, maar die kun je scheiden van de rest met een apolair oplosmiddel.

Vervolgens heb je een mengsel van triglyceriden en vrije vetzuren in de apolaire fase, en kun je indien nodig het apolair oplosmiddel afdampen, en daarna redelijk milde base-gecatalyseerde verzeping van triglyceriden naar vrije vetzuren doen, waarna je nog een keer een scheiding doet met apolair/polair oplosmiddel.

Het zijn behoorlijk aantal stappen, maar uiteindelijk heb je wel een prettig sample: vrije vetzuren in een apolair oplosmiddel. Dat oplosmiddel kun je er eventueel weer vanaf dampen, en daarna heb je alle mogelijkheden voor verdere analyse: Als je wilt weten welke vetzuren het precies zijn of iets dergelijks kun je het behandelen met TMS, of veresteren met methanol oid, en dan door de GC/MS halen om precies te zien wat je aan vetten hebt.

[Marko]

Ik begrijp niet waar dat verhaal vandaan komt dat er geen hydrolyse zou optreden.

[Kaasbaaz]

Ik begrijp niet waar dat verhaal vandaan komt dat er geen hydrolyse zou optreden.

Ik geloof dat vet alleen hydrolyseert in een basisch milieu

Maar als triglyceriden niet hydrolyseren ga ik er van uit dat hetzelfde geldt voor de fosfolipiden waaruit het celmembraan van dierelijke cellen bestaat. Dus wat ik mij heb laten vertellen dat er vet vrijkomt uit het cytoplasma van cellen klopt ook niks van .

[Benm]

Dat lijkt me inderdaad het geval - de fosfolipiden in het celmembraan zijn, wat de vetten betreft, diglyceriden, en die zouden niet moeten lyseren door wat zoutzuur.

Wat wel kan gebeuren is dat je door je zeer zure condities de cellen kapot maakt, gezien er ook eiwitten betrokken zijn bij het celmembraan. In waterig milieu houdt je dan de diglyceriden op zich wel intact, maar vormen ze dubbellagen, micellen en dat soort dingen.

[Marko]

Het gaat hier over 4 M zoutzuur en over koken. Lijkt op de Weibull-Berntrop methode, misschien deels gemodificeerd. Daar wordt het monster gedurende lange tijd, uren, gekookt. Bij mijn weten overleven triglycerides overleven dat niet, en maakt dat voor de bepaling ook niet uit.

[Benm]

Is dat niet een methode specifiek voor melk?

Dat is natuurlijk een vrij vetrijk product - als je vetzuren wilt isoleren uit een vetarm product waarbij het voornamelijk uit celmembranen en dergelijke moet komen heb je een heel andere situatie en methode nodig: het is een beetje als het verschil in succes tussen het uitbakken van vet uit speklappen versus uitbakken van vet uit gras: dat laatste gaat niet echt werken

[Marko]

Nee, niet specifiek voor melk.

En ik zeg ook niet dat ze die methode gebruiken, dat kan "kaasbaaz" beter aangeven.

Wel, dat het er op lijkt.

En, dat bij langdurig koken in 4 M zoutzuur, ook vetten zullen hydrolyseren.

Maar dat maakt niet zo uit bij een gravimetrische methode op basis van extractie.

[Kaasbaaz]

Sorry voor de late reactie. Ik kan geen bronnen vinden over Weibull-Berntrop behalve allemaal NEN/ISO verkoop sites, dus ik zou niet weten of het overeen komt.

Wij koken de oplossing precies 1 uur, ik ga er van uit dat deze tijd is bepaald als de beste tijd om al het vet vrij te krijgen zonder dat de triglyceriden worden gehydrolyseert.

Marko, heb jij misschien een linkje of weet je toevallig welke processen optreden tijdens de destructie bij Weibull-Berntrop?

Wat wel kan gebeuren is dat je door je zeer zure condities de cellen kapot maakt, gezien er ook eiwitten betrokken zijn bij het celmembraan. In waterig milieu houdt je dan de diglyceriden op zich wel intact, maar vormen ze dubbellagen, micellen en dat soort dingen.

Heb je hiervoor bronnen of goede kernwoorden om te googlen? "Lyse van prokaryoten", "Lysis in acid environment", etc werpen geen vrucht. Ook betwijfel ik of dit wel echt plaatsvind, want de micellen die onstaan zouden ook geëxtraheerd worden in de PET-ether toch? Ik kan me niet voorstellen dat ze dat door de vingers hebben gezien bij het opstellen van deze methode.

[Marko]

Nogmaals, waar komt de bewering vandaan dat triglyceriden niet worden gehydrolyseerd?

Dat het vetgehalte wordt gerapporteerd als triglyceriden (als dat al zo is) wil niet zeggen dat je extract ook daadwerkelijk triglyceriden bevat. Wat je meet is het gehalte in petroleumether oplosbare verbindingen. Triglyceriden zijn dat, maar
losse vetzuren ook. Aangezien je uiteindelijk de massa bepaalt, is de fout die je maakt het verschil in massa van 3 losse vetzuren ten opzichte van die van 1 triglyceride. Dat is een relatieve fout van minder dan 5%.

Sowieso i dat al geen grote fout, bovendien niet de enige fout, bovendien een die bij allerlei voedingsmiddelen op dezelfde manier zal doorwerken. Als het er om gaat voedingsmiddleen te kunnen vergelijken dus niet belangrijk.

En in verband met EU-regulering tenslotte, ook niet. Die staat voor gehaltes < 10 g/100g een afwijking van 1.5 g toe. Voor gehaltes tussen 20 en 40 g/100 g een fout van 20%, en voor nog hogere gehaltes een fout van ..... 5%

[Kaasbaaz]

Mij is heel duidelijk verteld dat we triglyceriden meten en geen losse vetzuren, alhoewel de informatie die ik heb gekregen van mijn stagebedrijf matig is op zijn best.

Zelf heb ik gelezen dat tryglyceriden slecht hydrolyseren in zuur, maar als jij zegt dat het binnen de EU norm valt (De analyse is geaccrediteerd, ik weet niet onder welke ISO) zou het zomaar kunnen.
Een ander punt is dat omdat het een zuur milieu is de vetzuren en glycerol meteen weer terug zouden kunnen veresteren denk ik.


Denk je dat dit iets is wat te onderzoeken valt? Als ik twee keer hetzelde monster meet maar eentje drie keer zo lang laat koken en ze uiteindelijk even veel massa hebben geëxtraheerd, dat ik dan kan zeggen dat al het vet na 1 uur al is gehydrolyseert omdat je anders na 3 uur een lagere massa verwacht terug te wegen door het missende glycerol?