Springen naar inhoud

Ionische sterkte verlagen


  • Log in om te kunnen reageren

#1

CarolineJanssens

    CarolineJanssens


  • 0 - 25 berichten
  • 9 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 11 mei 2008 - 15:48

Bij de aanmaak van een recombinant prote´ne moeten we eerst het mRNA dat codeert voor dit eiwit, afzonderen met behulp van kolomchromatografie.
We gebruiken dus een oligo-(dT)-kolom, aangezien mRNA op het 3'OH uiteinde gepolyadenyleerd is en dus weerhouden wordt op de kolom. Als het andere RNA en DNA (verkregen uit gehomogeniseerde cellen) weggeŰlueerd is, moeten we uiteraard het mRNA nog af de kolom krijgen, dit kunnen we blijkbaar doen door de ionische sterkte te VERLAGEN. Hoe doe je dit? Verhogen is simpel, maar verlagen?
Alvast bedankt!

Dit forum kan gratis blijven vanwege banners als deze. Door te registeren zal de onderstaande banner overigens verdwijnen.

#2

rwwh

    rwwh


  • >5k berichten
  • 6847 berichten
  • Moderator

Geplaatst op 11 mei 2008 - 16:43

Ik weet hier niets van, maar het klinkt alsof toevoegen van water (verdunnen) zou kunnen helpen?

#3

CarolineJanssens

    CarolineJanssens


  • 0 - 25 berichten
  • 9 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 11 mei 2008 - 17:00

Dat dacht ik zelf ook al, maar lijkt me zo verdacht gemakkelijk :)

#4

Napoleon1981

    Napoleon1981


  • >1k berichten
  • 2399 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 11 mei 2008 - 19:05

Gewoon elueren in gedemineraliseerd water als dat het mechanisme is.

#5

*_gast_Gerard_*

  • Gast

Geplaatst op 11 mei 2008 - 20:02

Het is niet mijn terrein maar op puur water en eiwitten heb ik het niet zo, ik zou toch heel zwak bufferen om de pH te stabilliseren.

#6

Pink Panther

    Pink Panther


  • >250 berichten
  • 516 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 11 mei 2008 - 20:02

Nee, niet met water.
Kijk, je bindt hier eigenlijk twee strengen aan elkaar. De primer (hier bestaande uit oligo-dT) laat je hybridiseren met de polyA-staart van het mRNA. De twee strengen zitten dus aan elkaar vast via de gebruikelijke waterstofbruggen. En indien mogelijk zitten ze nog lekker in een een helixvorm. Je moet deze binding dus goed kunnen breken. En dat gaat (naar mijn inziens) niet met water.
Ik dacht dat je de pH wat moest verhogen, zodat de strengen denatureren, dan zullen ze mee uitlogen.
Ik kan ook volledig mis zitten, ik ben namelijk geen expert!

#7

Napoleon1981

    Napoleon1981


  • >1k berichten
  • 2399 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 11 mei 2008 - 21:42

De opmerking van pinkpanter snijdt meer hout, maargoed dan is het mechanisme niet de ionsterkte verlagen wat de topicstarter aangeeft. Wat is je retentie mechanisme dus eigenlijk?

@Gerard, ik ben het met je eens dat ongebufferde systemen niet geweldig zijn.

#8

CarolineJanssens

    CarolineJanssens


  • 0 - 25 berichten
  • 9 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 12 mei 2008 - 09:45

Het enige dat hier voor retentie zorgt is de hybridisatie van de poly-A-staart met de ge´mmobiliseerde oligo(dT)kolom.. Om dus het poly-A-bevattende mRNA te kunnen eluŰren moeten in elk geval die A-T interacties weer dissociŰren, en dat kan blijkbaar ook door het verhogen van de temperatuur of toevoegen van formamide.
Maar het verlagen van de ionische sterkte blijkt ook een manier te zijn.
Verdunnen lijkt een logische verklaring, maar ik kan moeilijk geloven dat we het mRNA van de kolom gaan krijgen door toevoegen van water..





0 gebruiker(s) lezen dit onderwerp

0 leden, 0 bezoekers, 0 anonieme gebruikers

Ook adverteren op onze website? Lees hier meer!

Gesponsorde vacatures

Vacatures