Gelelectroforese

[Lilie]

Hallo allemaal,

Ik heb een vraagje over wat je moet doen als dna moleculen niet door de gel gelopen zijn. Deze zijn erg klein. Moet de concentratie TBE buffer verhoogd worden? Of moet de concentratie van de agarosegel verhoogd worden? 

Dankjulliewel!

[Jan van de Velde]

Opmerking moderator

Verplaatst naar het vakforum in de hoop op antwoord

[Wouter_Masselink]

Als DNA moleculen niet door een agarose gel gaan dan kan dat vanwege een aantal verschillende oorzaken zo zijn. De polariteit moet bijvoorbeeld correct zijn. Maar laten we even aannemen dat je daar geen fouten mee hebt gemaakt.
 
Over het algemeen zou ik geen TBE gebruiken, maar liever TAE. Dit is vooral belangrijk bij downstream ligaties en andere dingen die je misschien nog met je DNA wil doen. Als je alleen de gel wilt hebben en er verder niks mee gaat doen dan doet TBE het prima, zelfs beter voor kleinere fragmenten.
 
Voltage/cm, agarose %, TBE (0.5 of 1.0x) en fragment grote zal je op elkaar af moeten stemmen. Over het algemeen kan ik zeggen dat een 1x TBE beter werkt voor kleine fragmenten dan 0.5x TBE, meer dan 1.0x TBE is zeker niet beter. Het percentage van de gel kan je ook verhogen. Met een 2% agarose gel kan je nog steeds fatsoenlijk een 50 bp fragment waarnemen. zorg er ook voor dat je je EtBr direct aan de agarose gel toevoegt na het opkoken (laat de gel wel een beetje afkoelen aangezien het thermolabiel is).
 
Ik weet natuurlijk niet hoe lang je verwachtte fragment is, maar als je echt met hele kleine fragmenten te maken hebt dan zou je een speciale hoog percentage agarose kunnen overwegen of natuurlijk een polyacrylamide gel.