Wetenschapsforum

We willen proberen om Pseudomonas Sp. te isoleren uit een bodemmonster. Op internet hebben we verschillende methode's gevonde. Deze duren waarschijnlijk echter vrij lang. Dit werd o.a. gedaan via PCP en atrazine.

Weet iemand een betere methode?

Ik weet niet of er bepaalde technieken vereist worden, maar een eenvoudige manier lijkt mij gewoon isoleren met kweekmethode. Bloed-, nutriënt- en MacConkey-agar met toevoeging van cetrimide of antibiotica vormen media selectief voor Pseudomonas spp.

Kenmerken en meer gegevens bij deze kweek moet je maar vragen als je hiervoor meer interesse hebt, ik heb het in een boek (Bacteriologie voor laboratorium en kliniek van Knecht en Doornbos) staan maar ga niet alles overbodig uittypen

Ja gewoon isoleren en identificeren. M conkey, bloedagar etc. zijn allemaal toegestaan.

Een grampreparaat, katalase en coagulase lukt me zo zelf ook nog wel.

Als je een specifieke SOP hiervoor hebt dan zou ik deze graag zien (met bron?)

Hi Wouter,

sorry ik heb geen specifieke SOP voor je

Ik type hier wel even een stukje over uit het boek wat ik in mijn 1e reactie noem. Heb ook wel een stuk staan over klinische betekenis maar denk niet dat je interesse daarnaar uitgaat. Ik hoop dat je er wat aan hebt!

Morfologie

De Pseudomonas soorten zijn rechte, oflichtgebogen slanke Gram-negatieve staven, beweeglijk via polaire, mono- of multitriche flagellen. P.aeruginosa heeft slecht een flagel. Zeer muciïde stammen zijn soms onbeweeglijk

kweek

De meeste stammen zijn strikt aëroob. P.aeruginosa groeit in een breed temperatuurgebied van 5-42 graden. De optimale temperatuur is 37 graden. P.putida en P.fluorescens groeien niet bij 42 graden. P.putrefaciens groeit beter bij 30 graden, sommigen zijn psychofriel.

Bloed-, nutriënt-, en MacConkey agar zijn geschikte media. Door cetrimide of antibiotica toe te voegen worden de media selectief voor Paeruginosa en andere Pseudomonas soorten. De meeste soorten groeien in een mineraal basismedium met ammoniumzuren als groeifactoren. In bouillon groeit P.aeruginosa met een vlies aan de oppervlakte; op voedingsbodems vormt ze grote kolonies die plat, vaak ovaal en rough zijn. Daar waar kolonies dicht bij elkaar groeien, is bij sommige stammen van P.aeruginosa en P.fluorescens een zilverachtige glans te zien. Ze kunnen pigment vormen dat geelgroen (pyoverdine, fluorescine), blauwgroen (pocyanine), roodbruin (pyorubrine), of bruinzwart (pyomelanine) kan zijn. Kolonies en omgevend medium hebben deze kleur.

Vaak verspreid een cultuur van P.aeruginosa een specifieke geur, die weleens als een zoete viooltjes of druivenlucht beschreven wordt. Op bloedagar kunnen kolonies hemolytisch zijn. Sommige stammen produceren veel extracellulair polysacharide-slijm, waardoor op voedingsbodems slijmerige kolonies groeien. Voorall stammen afkomstig van patienten met mucoviscoidosis, waarbij P.aeruginosa veell voorkomt, vertonen dit kenmerk. P.putrefaciens produceert op agarmedia kolonies die licht viskeus of mucoïd en meestal roze of roodbruin zijn.

Biochemische eigenschappen

Alle Pseudomonas soorten beschikken over het enzym katalase, bijna alle soorten over het cytochhroomoxidase-enzymsysteem. Het stelt de m.o. mede in staat energie te verkrijgen uit oxidatieve reacties. Sommige soorten reducerenn nitraat om tot nitriet of tot stikstof.

Op enkele uitzonderingen na zetten bijna ale soorten glucose oxidatief om, dus alleen in aanwezigheid van zuurstof in de open buis.Hierbij wordt zuur gevormnd. Dit wordt vastgesteld met de oxidatie-fermentatietest van Hugh en Leifson. De Kligler-iron-agar of de triple-sugar-iron-agar worden ook vaak als eerste identificatiestap gebruikt.

Sommige P.aeruginosa-stammen, P.vesicularis en P.putrefaciens beschikken over het enzym DNase. P.putrefaciens vormt H2S.

Pigment

Enkele soorten,, waarvan P.aeruginosa, P.flurescens en P.putida de belangrijkste zijn, vormen in water oplosbare fluorescerende pigmenten (pyoverdinen). Deze pigmenten fluoresceren onder ultraviolet licht, bij een golflengte kleiner dan 260 nm. Ze zijn geelgroen, geelbruin of kleurloos. Ze zijn niet oplosbaar in chloroform. Ze worden vooral gevormd wanneer P.aeruginosa wordt geincubeerd bij een lage temperatuur, in alkalisch milieu en in aanwezigheid van magnesium- en sulfaationen. Ook de ijzerconcentratie in het medium is hierbij belangrijk. Fluorescerende pigmenten worden vooral gevormd wanneer de stam op King-B-medium wordt gekweekt.

Niet fluoriscerend pigment

Behalve het fluorescerende pigment hebben Pseudomonas soorten ook niet fluoriscerende pigmenten. P.aeruginosa vormt het pyocyanine dat blauw in neutraal of basisch milieu is en rood in zuur milieu. Het wordt gevormd in peptonbevattend medium. Pyocyanine kan men aantonen door enkele millinmeters chloroform aan een bouilloncultuur toe te voegen en deze te schudden. Wanneer men de buis laat staan,, ontstaan er 2 vloeistoflagen. Pyocyanine is dan in de chloroformlaag te zien, fluorescine niet. Pyocyanine wordt vooral gevormd wanneer de stam op King-A-medium wordt gekweekt. P.putrefaciens vormt bruin pigment. De pigmenten zijn oplosbaar in water enn chloroform.