CRISPR/Cas verwijderen genen

[Fini]

Beste wetenschappers,
 
Ik ben me op dit moment aan het verdiepen in de CRISPR/Cas technologie in planten. Ik heb hierover een vraag, die door mij niet terug te vinden is in papers of in google, omdat ik daarbij steeds de resultaten krijg die ik niet zoek.
Bij de CRISPR/Cas technologie, breng je eerst de benodigde genen in het genoom van de plant, met bijvoorbeeld Agrobacterium tumefaciens. Daarna kan de techniek werken, zoals uitgelegd in de papers (bijvoorbeeld een bepaald gen uitschakelen). Mijn vraag is echter hoe je die genen van de CRISPR technologie er weer uitkrijgt, zodat je een wildtype plant hebt met "jouw kapot gen".
 
Ik heb er zelf natuurlijk wel ideeen over, maar ik wilde weten of dit wel correct was. Het wordt namelijk naar mijn idee niet expliciet genoemd.
Ik denk zelf dat de genen alleen ingebracht worden op 1 chromosoom (random in het genoom), waardoor je deze genen er gewoon uit kan kruisen en kan checken met PCR specifiek voor deze genen? ik neem namelijk aan dat de CRISPR/Cas technologie beide genen op ieder chromosoom uitschakeld en je dat er dus niet uitkruisd.
 
Mocht er wat onduidelijk zijn in mijn verhaal, laat het dan even weten.
 
 

[Kravitz]

ik heb de literatuur er niet op nagelezen, maar dat is zeker een mogelijkheid. Verder herinner ik me ook dat CRISPR/Cas vaak transient gebruikt wordt (via Agro infiltratie). Mogelijks kan je dan via een callustap naar een volwaardige plant gaan met een mutatie in je gen van interesse.

[Jaffaa]

ik vind dit stuk een beetje vaag van je verhaal
Ik denk zelf dat de genen alleen ingebracht worden op 1 chromosoom (random in het genoom), waardoor je deze genen er gewoon uit kan kruisen en kan checken met PCR specifiek voor deze genen? ik neem namelijk aan dat de CRISPR/Cas technologie beide genen op ieder chromosoom uitschakeld en je dat er dus niet uitkruisd.
 
wat bedoel je precies met 'de genen worden alleen ingebracht op 1 chromosoom', naar mijn weten transcfecteer je een de target cell met een guide RNA die ervoor zorgt dat het CRISPR/Cas systeem een 'DSB' maakt op die plek, deze word vervolgens gerepareerd door de cel (dmv NHEJ of HR). hierdoor kan je kleine stukjes DNA als het ware in het genoom zetten van de target cell. (vanaf hier speculeer ik alleen maar, ik zit niet helemaal in dit veld ) Doordat je een stukje DNA in het genoom zet, zal de RNA guide dit niet meer herkennen en dus ook niet meer binden waardoor CRISPR/Cas kan werken. je moet wel weten dat deze techniek een enorm hot topic is, alles is nieuwe en zeker voor de gene editing applicatie weet men nog niet helemaal hoe het werkt. wel weet men dat het wss niet zo super goed werkt als de ontdekkers doen voorkomen. off target cleavage is een heel groot probleem, maar voor het lab is het een relatief goedkope en makkelijke manier om nieuwe cellijnen op te zetten.

[Fini]

Hallo,
 
Bedankt allebei voor jullie reactie. Ik heb inmiddels via kravits en een ander artikel kunnen vinden wat ik bedoelde.
 
Om toch even terug te komen op Jaffaa's reactie, ik denk dat je mijn stukje wat verkeerd begreep. Ik had het niet over CRISPR en wat het precies deed in het genoom (dat was mij wel duidelijk), maar hoe je de construct die je nodig hebt om CRISPR te laten werken weer uit je plantlijn kan halen (de DNA code om de gRNA en CAS tot expressie te laten brengen). Dit kun je inderdaad eruit kruisen, omdat agrobacterium random in het genoom verwerkt wordt, en de andere mogelijkheid was inderdaad transient werken.
 
Bedankt voor de reacties

[Jaffaa]

maar word dat dan niet gewoon door de planten cell zelf afgebroken (de RNA guide en de CRISPR eiwitten)? ik bedoel nadat de mutatie plaats heeft gevonden kunnen ze niks meer doen.. en de half life van eiwitten en de RNA guide zijn toch niet heel lang lijkt mij?  

[Fini]

Inderdaad, ze worden gewoon uiteindelijk afgebroken, net als andere eiwitten en RNA's
 
Waar het mij om ging is dit. je wilt bijvoorbeeld gen1 kapot maken. Dit kan je doen met CRISPR.
Daarvoor moeten CAS en de gRNA eerst tot expressie komen in de plant. dus je bouwt via transformatie de Cas/gDNA construct in het DNA van de plant. Deze komen tot expressie, waarbij je gen1 onschadelijk wordt gemaakt. Het punt met transformatie is natuurlijk dat het een GMO wordt, wat vaak niet handig is vanwege regels en dergelijke.
 
Een andere mogelijkheid die kravits aangaf was transient werken, dus geen transformatie.
 
ook al kunnen de eiwitten "niets meer doen" zoals jij aangeeft, de genen voor deze cas/gDNA construct komt nog wel gewoon tot expressie in de plant (mits het een transformatie betreft) en nieuwe eiwitten worden gewoon gemaakt.

[Jaffaa]

ik begrijp nu pas waar je heen wilde, je hebt helemaal gelijk ik had er geen rekening mee gehouden dat het een GMO word en je daarom alles eruit wilt hebben. 

[Wouter_Masselink]

Er zijn verschillende manieren om de extra genen die zijn ingebracht te verwijderen. Ten eerste zou je een epi-chromosomale methode kunnen gebruiken waarbij je nooit een intergratie in het genoom verkrijgt. Ten tweede zou je meerdere generaties een terug kruising op het orginele cultivar kunnen doen. Als je vervolgens selectief afkomelingen kiest, ben je rap genoeg van je extra inserties af.