Kloneren van IDH1-wildtype en IDH1-mutant R132H

[Nelleke1998]

Hallo iedereen!
 
Op onze studie zijn wij momenteel bezig met het kloneren van genen, en ik moet hier een plan van aanpak en onderzoeksverslag voor schrijven. Nu hebben we al een PCR en plasmideisolatie voor pBAD-HIS uitgevoerd. Vervolgens een restrictie-enzymdigestie, ligatie en transformatie. Momenteel hebben we E. coli TOP10 cellen met pBAD-HIS plasmide en gen uitgestreken op LB-agarplaten met ampicilline. Maar mijn vraag is hoe je nou kunt aantonen dat je gen juist georiënteerd is tegenover de plasmide en dat hij dus niet ondersteboven in het plasmide zit waardoor hij niet goed wordt getranscribeerd. Weet iemand welke methode je hiervoor zou kunnen gebruiken?
 
Mvg,
Nelleke Dinnessen

[Wouter_Masselink]

Je zou dit ouderwets mogelijkerwijs via restrictie analyze kunnen doen. Alternatief zou je dmv primers kunnen proberen om het stuk waar je gen en vector samenkomen te amplificeren en vervolgens te sequencen.
 
Als je verschillende sticky-ends hebt gebruikt op je insert dan is dit niet eens nodig en kan je er redelijkerwijs vanuit gaan dat je insert in de correcte orientatie staat. Als je blunt ended ligatie, of sticky ends met dezelfde overhang, hebt gebruikt dan moet je dit inderdaad even nakijken.

[Nelleke1998]

Super dankuwel! Heb begrepen dat we colony PCR iid met specifieke primers voor zowel de vector als de insert moeten gebruiken gecombineerd met een restrictie-enzymdigestie. Plus een positieve selectie om alles zeker te weten. Dus we zijn nog even bezig

[Wouter_Masselink]

Ik zou dit niet direct met een colony PCR doen. colony PCR is prima om een quick en dirty analyze te doen, maar om zeker te weten dat alles goed gaat -zeker met ongeteste primers- kan je beter eerst een miniprep doen.