western blotting

[Jacque]

Wie kan mij het principe van western blotting vertellen (eventueel ook een werkwijze geven). Thanks

[biochemiefreak]

Hallo jacque, welkom op het chemieforum

Ik moet zeggen dat dit wel een vraag is die je zelf heel makkelijk kunt vinden op het net. zie hier

Zoek dan eerst nog maar even verder en plaats vragen over deze algemene informatie.

Western Blotting is een scheidings methode berust op grote van specifieke eiwitten.

MvG Ron

[Gideon]

Het principe is als volgt:

eiwitten worden natief of met toevoeging van SDS (denatureert) op een polyacrylamide gel gescheiden. SDS heeft een negatieve lading en zorgt dat alle eiwitten gelijkwaardig naar hun lengte migreren bij blootstelling aan een spanningsveld.

Het blotten zelf gebeurt door een membraan (nitrocellulose of celluloseacetaat) op de gel te leggen en een spanningsveld verticaal er overheen te laten lopen.

Als gevolg komen de eiwitten op het membraan terecht, waarna ze specifiek worden aangetoond met antilichamen (2 sets)

Het primaire antilichaam is het meest specifiek, en het tweede is een algemeen antilichaam (bijv. geit anti-konijn)

Door de antilichamen te complexeren kan er een enzym aangevoegd worden (bijv. peroxidase) waarmee je kunt kleuren. Vaak gebruikt is de diaminobenzidine kleuring. Maar ook andere detectiemethoden zijn mogelijk: luminescentie en radiografie.

Hier wat info uit een oud rapportje van me:

SDS PAGE (Sodium Dodecyl Sulphate Poly Acrylamide Gel Electrophoresis)

Bij SDS PAGE worden twee factoren uitgeschakeld die bijdragen aan de migratiesnelheid van een eiwit, namelijk de eigen lading en vorm. Om dit te kunnen bereiken worden de eiwitten in een monsterbuffer gebracht en gedenatureerd in een waterbad. Aan deze monsterbuffer is Sodium Dodecyl Sulfaat (SDS) toegevoegd. Deze stof hecht aan de gedenatureerde proteïnen en geeft het extra negatieve lading, waarbij geldt: hoe groter het eiwitmolecuul, des te groter is de lading die het verkrijgt door SDS. De hoeveelheid lading verkregen door het SDS doet de eigen lading, eventueel positief, teniet. Aangezien alle eiwitten bij SDS PAGE in gedenatureerde, monomere vorm aanwezig zijn heeft ook de vorm van een eiwit geen invloed meer op de scheiding. Er is geen verschil meer in compactheid tussen proteïnen en de migratiesnelheid die hieruit voortkomt.

De Western Blot is een methode die met behulp van antilichamen specifiek eiwitsoorten kan aantonen. Hiertoe worden de proteïnen in de gel middels een transfer met een Western Blot apparaat toegankelijk gemaakt worden voor de antilichamen. Er wordt een zogenaamde sandwich van de gel gemaakt.

Het gebruikte apparaat lijkt op een normaal electroforese apparaat, maar in plaats van stroom over de gel te zetten, wordt er nu stroom loodrecht op de gel gezet. De proteïnen worden vanuit de gel op een membraan met grote affiniteit voor proteïnen getrokken. Veelgebruikt zijn membranen van celluloseacetaat of nitrocellulose.

Voordat detectie met antilichamen plaatsvindt, moet het membraan nog geblocked worden. Gezien het feit dat antilichamen ook proteïnen zijn moet voorkomen worden dat zij, bij het blotten in plaats van aan de te determineren proteïnen, aan het membraan gebonden worden. Dit kan worden bereikt door het membraan te verzadigen met een eiwitoplossing (bijvoorbeeld melk of BSA).

Om te controleren of daadwerkelijk alle proteïnen van de gel zijn gemigreerd kan de gebruikte gel gekleurd worden met een oplossing van Coomassie Blue. Door het kleuren zal de gehele gel een donkerblauwe kleur krijgen. Bij het ontkleuren van de gel met een destaining oplossing, zullen alleen de nog aanwezige proteïnen zichtbaar zijn door de gebonden kleurstof. De transfer is volledig gelukt wanneer er geen proteïnen zichtbaar worden tijdens dit proces en wanneer de uit de gel gemigreerde proteïnen daadwerkelijk op het membraan terecht zijn gekomen. Ook dit kan met behulp van een kleuring worden aangetoond. Deze kleuring vindt plaats met een oplossing van Ponceau S en geeft binnen zeer korte tijd een duidelijk beeld over de kwaliteit van de transfer. Ontkleuren van het membraan is niet nodig, het kan worden afgespoeld met demi-water.

Bij de daadwerkelijke immunoblotting op het membraan worden twee soorten antilichamen gebruikt, namelijk primaire en secundaire antilichamen. De keuze van antilichamen is onder meer afhankelijk van de gebruikte electroforesemethode. Bij natieve electroforese zullen de proteïnen nog in de oorspronkelijke conformatie aanwezig zijn en kan er gebruik gemaakt worden van zeer specifieke antilichamen. Bij SDS PAGE zijn de proteïnen in monomere vorm aanwezig en kunnen slechts antilichamen gebruikt worden welke een korte lineaire primaire structuur hebben.

De antilichamen worden aan het membraan gebonden door een incubatie van het membraan met antilichamen in een stoof bij 37C. Het primaire antilichaam hecht zich tijdens de incubatie aan het target eiwit en om achtergrondkleuring door niet sterkgebonden antilichamen te voorkomen wordt na incubatie het membraan uitgebreid gewassen om de overtollige antilichamen van het membraan te spoelen.

Bij een tweede incubatie worden de secundaire antilichamen aan de primaire antilichamen gebonden. Wanneer er HSA (Humane Serum Albumine) aangetoond moet worden dan worden er HSA antilichamen uit een ander organisme (bijvoorbeeld rund) gebruikt. Dit zijn de primaire antilichamen. De tweede groep antilichamen (bijvoorbeeld anti-rund lichamen uit een derde organisme, bijvoorbeeld geit) worden in de volgende stap aan de primaire antilichamen gebonden. (zie fig. 3). Dit gevormde complex is niet waar te nemen in deze vorm, maar kan zichtbaar gemaakt worden door een enzymatisch reactie, waarna kan worden waargenomen waar zich het complex en het target eiwit zich bevindt.[

Succes